تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

هدف : هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که  آیا MSCs  بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.

مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs  در محیط کشت -MEMα و  FBS %10  به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از  القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجم MSCs بدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH  وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی Nestin و βІІІ-tubulin  به منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­کنند استفاده شد.

نتایج: پاساژ پنجم MSCs که از موش صحرایی بالغ استخراج شدند، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر  βІІІ-tubulin واکنش مثبت نشان دادند. بررسی­های آماری نشان داده است که  MSCs در گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک  NGF و  GDNFو ژن­های نورونی  Nestinو Nurr1 را نسبت به گروه کنترل نشان دادند    .(p<0.05)

نتیجه گیری:  در این مطالعه نشان داده شد که MSCs در کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند  THو Nurr1را بیان کنند. مطالعات ما نشان می­دهد که  MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.

کلید واژگان: سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان،کشت طولانی مدت، تمایز خودبخودی، نوروسفر

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول: مقدمه. 1

مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته. 1

1-1 سلول­های بنیادی جنینی.. 3

1-2 سلول­های بنیادی بالغ. 4

1-3 سلول­های بنیادی مغز استخوان. 5

1-3-1 مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 10

1-4 کاربرد درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 14

1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی (NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها 17

1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک… 17

1-5-1-1 انواع فاکتور­های نوروتروفیک… 18

1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی.. 20

1-5-2-1 ساختار گیرنده P75^NTR و اتصال نوروتروفین.. 20

1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین.. 22

1-6 سلول­های بنیادی عصبی.. 25

1-6-1 نوروسفر. 25

1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی.. 31

1-7 ضرورت اهداف تحقیق.. 33

فصل دوم: مواد و روش­ها. 35

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی.. 36

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ. 36

2-2-1 طرز تهیه محیط کشت    a-MEM.. 36

2-2-2 طرز تهیهPBS   فاقد کلسیم و منیزیم (2/7 : PH) 37

2-2-3 طرز تهیه تریپسین/ EDTA. 37

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان. 39

2-2-5 پاساژ سلولی.. 39

2-3 تأیید هویت سلول‌های استرومایی به روش ایمونوسیتوشیمی.. 39

2-3-1 ایمونوسیتوشیمی CD71. 40

2-3-1-1 طرز تهیه پارافرمالدئید 4%. 41

2-3-1-2 طرز تهیه ژلاتین 1/0 درصد. 41

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%. 41

2-3-1-4 طرز تهیه PBS  ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH). 42

2-3-1-5 طرز تهیه بافر گلیسرول.. 42

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز 43

2-4بررسی مارکر عصبی  βIII-tubulin در سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان  به روش ایمونوسیتوشیمی.. 44

 2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ایمونوسیتوشیمی.. 45

2-6 بررسی مولکولی بیان ژن­های اعضای خانواده نوروتروفین.. 46

2-6-1 استخراج RNA کل از سلول‌های کشت شده 46

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNA استخراج شده 48

2-6-3 الکتروفورز ژل آگارز 49

2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونویسی معکوسRT-) 52

2-6-5 انتخاب پرایمر. 53

2-6-6 آماده‌سازی پرایمرها 54

2-6-7 واکنش PCR. 54

2-7 آنالیز آماری.. 58

فصل سوم: نتایج… 59

3-1 مشاهده مورفولوژی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت.. 59

3-2 تعیین هویت سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالین فسفاتاز. 60

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت.. 60

3-4 تأیید هویت سلول‌های عصبی با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی.. 60

3-5 تأیید هویت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین.. 61

3-6 ارزیابی بیان ژن­های فاکتورهای نوروتروفیک و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن 61

4-1 نتیجه­گیری و بحث 70

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها 71

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 72

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی.. 74

4-4 تولید نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان در کشت طولانی مدت.. 76

4-5 نتیجه گیری.. 77

پیشنهادات.. 77

مراجع  

برای دانلود پایان نامه اینجا کلیک کنید